附件：應用于結直腸癌篩查及輔助診斷的糞便多靶點聯合檢測試劑非臨床研究審評要點（2025年第15號）.doc

應用于結直腸癌篩查及輔助診斷的
糞便多靶點聯合檢測試劑
非臨床研究審評要點

本審評要點主要針對糞便多靶點聯合檢測試劑的分析性能、陽性判斷值、穩定性、主要原材料及生產工藝等研究過程，為體外診斷試劑注冊申請人和技術審評部門提供參考。

本審評要點是基于特定申報產品的基因點突變、甲基化及便隱血檢測試劑的一般要求，注冊申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本審評要點是供注冊申請人和技術審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關法規的前提下使用本審評要點。如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本審評要點是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

本審評要點適用于采用免疫法和實時熒光PCR法，體外定性檢測人糞便樣本中血紅蛋白聯合基因點突變和/或基因甲基化的聯合檢測試劑。檢測結果通過計算綜合評分，用于對結直腸癌高風險人群的篩查或臨床結直腸癌疑似患者的輔助診斷。

對于適用于其他樣本類型，不同檢驗原理或組合形式的聯合檢測產品，可能部分要求不完全適用或本文所述內容不夠全面，申請人可以參照本審評要點，根據產品特性對適用部分進行評價或補充其他的評價資料進行相應驗證。

二、注冊審查要點

（一）監管信息

1.產品名稱及分類編碼

產品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規的要求，明確突變基因、甲基化基因、便隱血等檢測靶標。按照《體外診斷試劑分類規則》，該產品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.注冊申請人還需提交產品列表、關聯文件、申報前與監管機構的聯系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

內容應符合《醫療器械監督管理條例》和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》的相關要求，主要包括概述、產品描述、預期用途、申報產品上市歷史及其他需說明的內容。建議申請人著重介紹以下幾方面內容：

申請人應依據臨床上結直腸癌篩查與診療的相關要求，對高風險人群的選擇提供充分的支持資料，包括診療指南或專家共識等。多項標志物的選擇及組合應具有科學性和臨床價值。應詳述靶基因、突變位點、甲基化位點的篩選依據及過程。介紹靶基因、點突變及甲基化的生物學特征及臨床意義，中國人群點突變頻率，基因甲基化的組織特異性，提供健康人基因甲基化的基線水平等相關信息，提交文獻依據。

比較多項標志物聯合檢測與單項標志物檢測的診斷效能差異，還應與臨床已有公認的篩查方法比較異同，確認多項標志物聯合檢測的產品設計具有臨床價值。

產品描述中應詳述各靶標檢測原理，引物探針設計及其與檢測位點的對應關系，內標選擇與質控的設置，如有防污染措施，需描述防污染的原理。陽性判斷值需計算后進行判讀的產品，應詳述計算原理、系數選擇和判讀規則。

（三）非臨床資料

1.產品技術要求及檢驗報告

1.1 產品技術要求

申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據產品研制、前期評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻資料，結合產品特性按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（2022年第8號）的要求編寫產品技術要求。該類產品作為第三類體外診斷試劑，應將主要原材料及生產工藝要求等內容作為附錄附于產品技術要求正文后。

如有適用的國家標準、行業標準，產品技術要求的相關要求應不低于相應的要求。

1.2產品檢驗報告

根據《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》的要求，申請人應當提供三個不同生產批次產品的檢驗報告，有適用的國家標準品的，應當使用國家標準品對產品進行檢驗。報告形式可為申請人出具的自檢報告或委托有資質的醫療器械檢驗機構出具的檢驗報告。申請人開展自檢的，應當符合《醫療器械注冊自檢管理規定》及相關法規的要求。

2.分析性能評估

注冊申請人應當在原材料和生產工藝經過選擇和確認、質量管理體系得到有效控制并且保證產品質量穩定的基礎上，采用完整、確定的檢測系統進行分析性能評估，包括具體研究方法、質控標準、試驗數據、統計分析等詳細資料。對于本類產品建議著重對以下分析性能進行研究：

如試劑用于不同適用機型，需要在不同機型上分別進行性能評估。

當產品包含多項被測物時，原則上應針對所有被測物分別進行檢測性能評價。如不適用，應提供充分的理由和依據，并采用合理的方法進行檢測性能評價。

需多靶標綜合判斷陰陽性的產品，除單項被測物的性能評價研究外，還應提供綜合檢測結果評價資料。

分析性能評估內容包括樣本穩定性、適用樣本類型、DNA提取/純化性能及甲基化DNA轉化性能、準確度、精密度、檢出限、分析特異性、鉤狀效應等研究。

2.1樣本穩定性

樣本穩定性可包括樣本處理不同階段的樣本穩定性研究，一般包括樣本各種實際運輸及儲存（常溫、冷藏和冷凍）條件下的保存期限驗證，以確認樣本的保存條件及保存時間。可以在合理的溫度范圍內，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行驗證，從而確認不同類型樣本的穩定性。可冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行合理驗證。應明確具體的保存溫度范圍。

如核酸提取產物可保存，還需對核酸提取產物的保存條件和保存時間進行研究。

如甲基化DNA轉化后的樣本可保存，需提交轉化后的樣本穩定性研究資料。

2.2適用樣本類型

產品適用的樣本類型為人糞便樣本。根據布里斯托（Bristol）大便分類法，糞便樣本分為7個型別。應收集7種型別的糞便樣本，分別對不同型別的檢出結果進行研究。對不適用糞便類型應在說明書明示。

2.3 DNA提取/純化性能及甲基化DNA轉化性能

申請人應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度、DNA完整性進行評估，此外需結合試劑對檢出限、重復性、抗干擾性能等進行充分的驗證。

DNA甲基化檢測需要針對不同的樣本類型與檢測應用選擇適宜的轉化方法。對于通過重亞硫酸鹽處理DNA的情形，應提交重亞硫酸鹽處理試劑的篩選研究、不同甲基化比例樣本的轉化效率研究、DNA的回收效率等性能研究，設定相應的質量標準。

2.4準確度

使用經確認的臨床樣本進行檢測，包括進展期腺瘤以及不同分期（I-IV）的結直腸癌樣本，評價申報產品基因點突變/甲基化檢測結果與對比試劑/方法檢測結果的一致性；評價申報產品便隱血檢測結果與已上市試劑檢測結果的一致性。

針對所有被測基因，建議采用境內已上市同類產品作為對比試劑，與之進行比較研究。如選擇同類產品，應確認具有良好的可比性。如該基因點突變/基因甲基化檢測尚無同類產品上市，可采用適合的基因檢測實驗室參考方法作為對比方法，例如Sanger測序法、NGS、數字PCR等。

需多靶標綜合判斷陰陽性的產品，除單項被測物的準確度評價研究外，還應提供綜合檢測結果的評價資料，可與最終病理結果比對。

2.5精密度

使用不同濃度和不同甲基化比例的臨床樣本，采用三批試劑對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應包含核酸提取/純化及甲基化DNA轉化步驟。

2.6檢出限

在不同DNA濃度下（該背景DNA濃度建議參考患者糞便樣本），對含有不同比例基因突變、不同比例DNA甲基化的樣本進行檢測，確定樣本的檢出限。可使用不同DNA濃度、不同甲基化比例的樣本進行研究，采用臨床陰性基質進行稀釋，每濃度梯度使用三批試劑分別在適用機型上檢測至少20次，將檢出率大于等于95%的最低濃度水平確定為檢出限。

研究便隱血檢測試劑對低濃度血紅蛋白的陽性檢出率，檢測至少20次，將檢出率大于等于95%的最低濃度水平確定為檢出限。

也可選用其他合理方法進行檢出限的建立。

檢出限的驗證可使用三批試劑在適用機型上對檢出限濃度水平的臨床樣本檢測至少20次，陽性檢出率應不低于95%。檢出限可表示為xx濃度的野生型DNA背景下*%的基因突變及DNA甲基化。便隱血檢測試劑的檢出限表示為xx濃度。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應

采用靶基因的野生型及其他常見突變的樣本、甲基化靶基因的未甲基化樣本或其他常見位點的甲基化樣本進行交叉反應研究。便隱血項目應考慮血紅蛋白結構類似物對產品檢測結果的影響。

采用其他惡性腫瘤尤其是消化道惡性腫瘤患者（如食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌等）、消化道良性疾病患者（如炎癥性腸病、消化道潰瘍、結直腸息肉等）糞便樣本，評價對本試劑檢測結果的影響。

2.7.2干擾試驗

對于基因點突變檢測、基因甲基化檢測項目，常見內源性干擾物質包括血紅蛋白、膽紅素、白細胞、血清蛋白、多糖等；常見外源性干擾物質包括維生素C、膳食纖維、消化道疾病常用藥物（通便靈、西咪替丁等H2受體拮抗劑、奧美拉唑等質子泵抑制劑、硫糖鋁等胃黏膜保護劑、乳酸桿菌等胃腸道益生菌、嗎丁啉等促胃腸動力藥、胰酶等消化酶補充劑）。

對于便隱血項目，干擾物質包括動物血紅蛋白、肌紅蛋白、維生素C等。

2.8便隱血檢測試劑的鉤狀效應

采用不同濃度梯度的人血紅蛋白進行檢測，評價一定濃度的人血紅蛋白對試劑檢測結果的影響。當出現反應強度隨濃度升高反而降低的情況，即為出現鉤狀效應的最低濃度。

2.9反應體系

2.9.1基因點突變檢測、基因甲基化檢測試劑的反應體系，包括核酸提取用樣本體積、洗脫體積、DNA轉化用核酸樣本體積、DNA轉化條件、反應體系中的加樣量（包括采樣次數及重量）、試劑用量、反應體系各成分終濃度(如酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等)。對于多重PCR反應體系，應針對靶標與內標的擴增效率及相互影響進行充分研究。

提供PCR反應各階段溫度、時間及循環數、熒光采集時間的研究資料。提供不同機型基線、閾值、閾值循環數（Ct）、熒光強度確定的研究資料。

提供質控體系設置、Ct值確定的研究資料。

不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

2.9.2便隱血檢測試劑的反應體系研究資料，包括加樣方式、加樣量（包括采樣次數及重量）、反應時間、反應溫度、膜孔徑大小（或移行速度）（如有）等條件對產品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。還應考慮樣本加樣后觀察時間對產品檢測結果的影響，通過試驗確定最佳的觀察時間。

3.穩定性研究

申報試劑的穩定性主要包括實時穩定性（有效期）、開瓶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制（如適用）等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括具體的實施方案、詳細的研究數據以及統計分析結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批產品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4.陽性判斷值

建議納入一定數量的臨床樣本，結合產品特性，可采用受試者工作特征曲線（ROC）或其他合理方法確定靶基因陽性判斷值。采用臨床來源的未經治療樣本，根據預期用途可納入目標癌種、癌前病變、良性疾病、其他惡性腫瘤等樣本進行陽性判斷值研究，包括不同病理類型、不同分期、不同突變及甲基化比例等，同時分期進行統計。

針對篩查試劑，還應納入無腸道相關癥狀的高危人群樣本，同時應盡量多納入結直腸癌I期樣本和II期樣本。

提交內標基因的Ct值確定研究資料，可采用百分位數法確定內標基因的Ct值范圍。

申請人應詳細闡述所采用方法的選擇依據，提交詳細研究方案、建立和驗證設計、試驗數據和統計分析過程。明確所用樣本類型、樣本來源、樣本量估算的方法、樣本例數、臨床背景信息、基因甲基化確認過程及數據等信息。

結合便隱血聯合基因點突變和/或基因甲基化檢測結果，以最終病理結果為金標準，采用ROC法結合邏輯回歸模型，建立計算公式。公式包含全部靶標及其對應的不同回歸系數（權重）。選擇約登指數最大值點或者平衡臨床性能最優的靈敏度和特異性界值，從而確定試劑的陽性判斷值，即為最終結果。

5.其他資料

5.1主要原材料

主要原材料研究資料通常可包括核酸提取試劑/純化試劑、DNA轉化試劑、引物、探針、DNA聚合酶、UNG酶（如有）、dNTP、抗體等，此外還包括對照品/質控品及企業參考品。申請人應提交相關原材料的來源、選擇、制備方法的研究資料，質量分析證書，質量標準的制定和檢驗資料。如為申請人自制，應提供其詳細制備過程；如為外購，還應提交生產商篩選資料以及生產商提供的原材料質量檢定報告。

5.1.1核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。如產品不包含提取試劑，則需明確配套的核酸提取/純化試劑并提交相應的提取效率驗證資料。

5.1.2 DNA轉化試劑，明確主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。如產品不包含DNA轉化試劑，則需明確配套的DNA轉化試劑并提交相應的轉化性能驗證資料。

5.1.3 引物、探針

申請人應詳述點突變、甲基化基因及內標基因、引物、探針的設計原則，擴增區段，檢測覆蓋的突變、甲基化位點及其所在基因位置并提供選擇依據，同時應提供引物、探針核酸序列及其對應的檢測位點的對應關系。

申請人應針對選定的引物探針原材料進行質量評價，一般包括：序列準確度、純度（HPLC純等）、濃度、探針熒光標記基團的激發波長和發射波長（如適用）以及功能性試驗等，明確研究方法并依據評價結果建立合理的質量標準。

5.1.4酶

酶包括DNA聚合酶和/或尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性、熱穩定性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質量標準。

5.1.5脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP，應提交對其純度、濃度等的驗證資料以及功能性試驗資料，并確定質量標準。

5.1.6對照品/質控品

試劑應根據檢測原理設置各種對照品（質控品）來實現對產品整個反應體系的有效監控。陰性和陽性質控品一般為一定濃度的野生和突變位點樣本、甲基化陰性和陽性樣本、便隱血檢測陰性和陽性樣本。空白對照為不含靶標的溶液。核酸檢測試劑對照品應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供對照品原料選擇、制備、基因序列確認、拷貝數及濃度確定過程、內標基因與靶基因的比例確定等的詳細研究數據，并對其檢測結果做出明確的范圍要求。

申請人應對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，明確所采取的具體措施（如設置內標等）、選擇依據，并提交相應研究資料。

5.1.7企業參考品

提交企業參考品的研究資料，包括來源、組成、陰陽性和/或量值確認等。

企業參考品可采用臨床樣本或來源于細胞系的DNA樣本。

需多靶標綜合判斷陰陽性的產品，應同時設置綜合計算后為陽性及陰性的參考品。

基因點突變陽性參考品包括基因突變弱陽性（低突變頻率）參考品、基因突變中陽性（中等突變頻率）參考品和基因突變強陽性（較高的突變頻率）參考品，可為一定濃度下糞便樣本DNA和基因突變細胞系DNA樣本的混合。

基因甲基化陽性參考品包括弱陽性（低甲基化比例）參考品、中陽性（中甲基化比例）參考品和強陽性（較高的甲基化比例）參考品，可為一定濃度下糞便背景DNA含不同比例甲基化基因的樣本。

基因點突變和甲基化的檢出限參考品應分別包含全部突變位點、全部甲基化基因位點，應設置檢出限水平濃度的參考品。

精密度參考品可依據不同反應體系，如單獨檢測便隱血樣本的反應體系，基因點突變和基因甲基化的反應體系，分別設置中、低濃度水平的參考品。

陰性參考品應包含易發生交叉的其他良惡性疾病樣本和干擾物質。

便隱血參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品，應根據產品情況進行合理設置。

5.2生產工藝

介紹產品的主要生產工藝，可用流程圖結合文字的方式表述，提交主要生產工藝的確定及優化研究資料。